小麦(Triticum)是全世界广泛种植的粮食作物，其在中国的种植面积仅次于水稻(彭居俐和何中虎, 2009)。由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病，是三种小麦锈病中分布最为广泛的一种。小麦感染叶锈菌后通常会造成5%~15%的减产(Komer, 1996)，严重时会达到40% (Knott, 1989)。在1969年、1973年、1975年和1979年，由于叶锈病在西南及长江流域部分地区大面积爆发造成小麦严重减产(董金皋, 2001, 中国农业出版社, pp.44-45)。近年来由于温室效应致使气温变暖，加之为了提高产量田间种植密度大，水肥条件高，这些都有利于叶锈病的发生，例如2012年中国甘肃省大面积爆发了小麦叶锈病(http://v.youku.com/v_show/id_XNDUwNzAyMjA4.html/)。培育和利用抗病品种是一种长期有效的防治小麦叶锈病的方法，到2012年为止，小麦中已发现了近100多个抗叶锈基因，71个已经被正式定名(Singh et al., 2013)，但仅有少数基因在中国表现有效抗性，因此持续筛选抗病基因和培育抗病品种是小麦抗病育种人员的主要任务之一。

小麦抗叶锈遗传的研究根据实验目的的不同，加上试验要求的差别，可以选择不同的分析方法。小麦抗叶锈遗传研究方法主要包括基因推导法、染色体定位及分子标记等。近年来，本实验室利用SSR分子标记技术在小麦抗叶锈遗传研究中定位了一些新的抗叶锈基因：Zhang等(2011)在小麦品种毕麦16中利用SSR标记发现一个新的抗叶锈基因LrBi16，将其定位到了7B染色体上；Zhou等(2013)在小麦品种内江977671中同样是利用SSR标记发现了一个新的抗叶锈基因LrNJ97，将其定位在2BL上。目前成功应用SSR技术标记的小麦抗叶锈基因还有Lr13 (Messmer et al., 2000)、Lr19 (Zhang et al., 2005; 李星等, 2005)、Lr34 (Suenaga et al., 2001)、Lr37 (Blaszczyk et al., 2004)、Lr39 (Raupp et al., 2001)、Lr45 (张娜等, 2007)、Lr46 (Suenaga et al., 2001)、Lr50 (Brown-Guedira et al., 2003)、Lr52 (Hiebert et al., 2005)、Lr58 (Kuraparthy et al., 2007)和Lr61 (Herrera-Foessel et al., 2008)等。

小麦品系渝356-9在田间对叶锈病表现较好的抗性，但至今还未有与其相关的抗性研究报道，本研究旨在利用遗传学方法结合分子标记对小麦品系渝356-9进行初步研究，定位其所含有的抗叶锈基因，为抗叶锈品种的育种工作提供材料，为抗叶锈病的遗传机理奠定理论基础。

1结果与分析
1.1抗病基因的遗传分析
1.1.1苗期抗性鉴定
用叶锈菌小种FHNQ分别接种抗病亲本渝356-9，感病亲本郑州5389及待测群体的F₁、F₂代单株，14 d左右待感病株发病完全以后对其进行反应型的鉴定。20株抗病亲本渝356-9均表现抗病，侵染型为；1级，20株感病亲本均表现感病，侵染型为4级，20株F₁代单株全部抗病，反应型为；1 2级，F₂代群体共159株，其中抗病110株，感病49株，卡方测验符合抗感3:1的理论比例(χ²_0.05=2.87<χ²_0.05=3.84) (表1)，推测渝356-9中的苗期抗叶锈性是由一对显性基因控制的。

表1 渝356-9, 郑州5389及其F1, F2群体单株对FHNQ的苗期反应型 Table 1 Yu 356-9, Zhengzhou 5389 and F1, F2 lines’ seeding phenotypes inoculated with Chinese P. triticina race FHNQ

1.1.2成株抗性鉴定
对成株期亲本及139个F₂单株接种小麦叶锈菌FHNQ，鉴定结果分为高抗R，中抗MR，中感MS，高感S四个等级。渝356-9表现高抗，郑州5389表现高感，F₂代单株中有104株表现抗病，35株表现感病，卡方检测符合抗感比3:1的比例(χ²_0.05=0.024< χ²_0.05=3.84) (表2)。

表2 F2代群体成株期抗性鉴定 Table 2 F2 lines’ adult phenotypes

1.2连锁分析及遗传作图
1.2.1分子标记筛选和基因定位
本研究共用到1 082对分布于21条染色体上的SSR引物，对两个亲本及抗感池依次进行筛选，筛选出3对(Xbarc55, Xgwm148和Xgwm410)引物，在两亲本及抗感池间均表现出多态性，且分布在2BS上。因此将该基因初步定位于2BS染色体上，暂命名为LrYu。

1.2.2连锁分析与LrYu的分子作图
利用在亲本与抗感池中表现多态性的3对引物分别对159个F₂代单株进行PCR扩增和电泳检测，均与LrYu连锁，遗传距离从9.3 cM到26.1 cM，其中最近的标记为Xgwm410，遗传距离是9.3 cM。如图1所示M为pBR322/MspⅠ Marker，标注为R1的是抗病亲本渝356-9条带，标注为S1的是感病亲本郑州5389条带，Br为抗病池，Bs为感病池，R2到R11代表F₂代抗病材料条带，S2到S11代表F₂代感病材料条带，箭头表示在亲本及F₂代材料中含有的特异条带。

图1 引物Xgwm410在F2代中扩增出的特异性条带 注: M: pBR322/MspⅠ marker; 箭头表示在亲本及F2代材料中含有的特异条带; R1: 抗病亲本渝356-9; S1: 感病亲本郑州5389; Br: 抗病池; Bs: 感病池; R2~R11: 抗病单株; S2~S11: 感病单株 Figure 1 Electrophoresis of PCR products amplified with SSR marker Xgwm410 on polyacrylamide gels Note: M: pBR322/MspⅠ marker; Arrows indicate the specific bands from the PCR of the parents and F2 lines; R1: The resistant parent Yu 356-9; S1: The susceptible parent Zhengzhou 5389; Br: The resistant bulk; Bs: The susceptible bulk; R2~R11: Resistant lines; S2~S11: Susceptible lines

2讨论
2.1抗叶锈基因LrYu的遗传分析与连锁作图
本研究应用分子标记的方法对渝356-9的抗叶锈性进行遗传分析，构建了遗传连锁图。据Somers等(2004)构建的连锁图可知Xgwm410位于2BS，连锁分析结果表明Xgwm410与LrYu的遗传距离为9.3 cM (图2)，因此将LrYu定位于2BS染色体上。Xgwm410与其他2个SSR分子标记(Xgwm148, Xbarc55)共同构建了LrYu遗传连锁图，该图谱定位的3个SSR标记的位置与Somers等(2004)构建的连锁图中标记的位置基本一致。

图2 抗叶锈基因LrYu的SSR连锁图 Figure 2 Linkage map around the resistance gene LrYu constructed with SSR markers

2.2与已知基因的关系
目前已命名的抗叶锈基因共71个，其中定位在2B染色体上的有Lr13、Lr16、Lr23、Lr35、Lr50和Lr58。其中Lr13在我国小麦品种中出现的概率为5.40% (袁军海和陈万权, 2011)，研究证实Lr13是位于2BS上的成株抗性基因，具有高温慢锈性(陈万权和秦庆明, 2002)，但其抗性也存在小种专化性，且在近些年来由于其专化性，已对相当一部分小种出现慢锈性丧失的情况。作为主效基因的Lr16和Lr23位于2BS，在中国也已基本丧失抗性。Lr35为成株抗病基因，Lr50和Lr58是位于2BL上的主效抗叶锈基因。定位在2BS上的LrYu具有苗期抗叶锈性和成株抗叶锈性，并且苗期抗叶锈性鉴定结果表明渝356-9与其他含有定位在2B染色体上的小麦抗叶锈病基因的小麦近等基因系品种具有不同的反应模式。因此可知，LrYu不同于已知的抗叶锈病基因，对大多数中国叶锈菌有效，该基因的发掘有利于充实抗病基因库，为培育抗病品种提供更加丰富的抗源。

3材料与方法
3.1实验材料
抗病材料小麦品系渝356-9，感病材料郑州5389及其杂交得到的F₁、F₂代群体。研究所用到的携带不同毒性基因和毒性基因组合的叶锈菌生理小种采自中国小麦的各主产区，由本实验室纯化扩繁，按Long和Kolmer (1989)等的小麦叶锈菌密码命名系统(Prt-code System)命名。以上实验材料均由河北农业大学小麦叶锈病研究室提供。

3.2苗期抗病性分析
 将得到的F₁、F₂的种子种于温室中，待第一片叶展开后用扫抹法接种小麦叶锈菌。接种后两周左右发病充分时进行鉴定(Kuraparthy et al., 2007)，植株的表现型按坏死斑的有无和孢子堆的大小分为0、；、1、2、3和4等6个等级，0~2级为抗病，3~4为感病。将记录结果总结，用Dubin等(1989)提出的方法进行基因推导。

3.3基因组DNA提取和抗、感池的构建
参照Gill等(1991)提供的CTAB法提取小麦叶片基因组DNA，用1×TE将其稀释到所需浓度。根据表型调查的结果从F₂代中选取10株高抗和10株高感的单株，各自等量混合成抗病池和感病池(Gupta et al., 2005)。

3.4微卫星引物扩增及电泳检测
共筛选1 082对分布于小麦21条染色体上的SSR引物，部分参考Röder等(1998)，其余由GrainGenes (http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes/browse.cgi/)提供。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SSR引物筛选PCR体系10 μL，反应液由10×PCR Buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，引物(4 μmol/L) 1 μL、模板DNA 1 μL，Taq酶0.1 μL，ddH₂O 6.7 μL组成。引物初筛PCR程序为：预变性94℃，5 min；进入35个循环：变性94℃，1 min；退火50℃、55℃或60℃ (依据引物而定)，1 min；延伸72℃，1 min；循环结束，最后再延伸72℃，10 min。然后用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，用硝酸银染色后观察结果。

3.5数据分析
利用MapManager QTXXb20软件分析实验数据，计算所得标记与抗病基因的遗传距离，并绘制连锁图谱。

作者贡献
李星和韩柳莎是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王佳真完成数据分析和论文初稿的写作；康占海参与实验设计和试验结果分析；刘大群和李星是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由中国博士后基金项目(2011M500672)和河北省教育厅优秀青年基金项目(YQ2013024)共同资助。

参考文献
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